圖1：樣本制備流程。

A. 組織保存：石蠟包埋(FFPE)和冷凍保存；

B. 根據(jù)最終應(yīng)用，組織塊切成不同厚度的切片；

C. 在二甲苯、梯度酒精中進(jìn)行脫蠟和水化；

D. 熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)；

E. PAP筆在組織切片周圍畫圈施加疏水屏障，將試劑限制在特定范圍內(nèi)。

*脫蠟和水化僅適用于FFPE組織切片；

**對于解剖后速凍的組織，可能不需要熱誘導(dǎo) 抗原修復(fù)；無論后續(xù)選擇石蠟包埋還是冷凍保存，經(jīng)過福爾馬林固定的標(biāo)本進(jìn)行抗原修復(fù)都能改善染色。

組織樣本的長期保存主要分為2類：石蠟包埋和冷凍保存

石蠟包埋：?.醛類固定; ?.梯度酒精脫水; ?.二甲苯透明; ?.石蠟浸透。

經(jīng)由福爾馬林固定( 防止組織自溶和腐敗；保存組織形態(tài))；接著，固定的組織經(jīng)過一系列從低濃度到高濃度的梯度酒精處理；然后，與有機(jī)溶劑(如二甲苯)孵育去除酒精；最后一步，使用溫?zé)岬氖灲附M織，然后冷卻硬化，形成福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊(FFPE)。

冷凍保存：將生物樣本在-20℃或-80℃下冷凍，是保存組織用于IHC應(yīng)用的另一種選擇。常規(guī)冷凍流程：新鮮組織在液氮、異戊烷或干冰中速凍，用OCT包埋，再用冷凍切片機(jī)切片。組織固定通常在切片后進(jìn)行，固定劑可選擇丙酮、甲醇、乙醇和甲醛等。

固定劑選擇tips(左圖)	石蠟包埋和冷凍保存流程圖(右圖)

快速冷凍樣本是保持組織和細(xì)胞形態(tài)的關(guān)鍵。如果冷凍速度過慢，會導(dǎo)致大冰晶的形成，從而破壞形態(tài)結(jié)構(gòu)。下面是兩種快速冷凍樣本的方法：

?. 在一個盛有液氮的小型杜瓦瓶中，放入一個裝有異戊烷的金屬容器。用鋁箔紙包裹組織，然后將其浸入冰冷的異戊烷中。

?. 將干冰粉碎并放入一個小型聚苯乙烯泡沫盒(泡沫箱)中。將組織放入盒中，并用粉碎后的干冰將其覆蓋。

組織經(jīng)冷凍或石蠟包埋后，需分別使用冰凍切片機(jī)或石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片。切片的常規(guī)厚度需根據(jù)最終實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩āFPE蠟塊和冷凍組織都適用于制備薄切片和厚切片；但在需要超薄切片(<6μm)的應(yīng)用中，F(xiàn)FPE蠟塊的切片效果通常優(yōu)于冷凍組織。研究人員可針對不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膰L試多種切片厚度，以確定最佳條件。

薄切片：需要高顯微鏡分辨率，且視野內(nèi)僅需觀察少量細(xì)胞時，薄切片是首-選；

厚切片(>6μm)：研究腦組織3D形態(tài)或神經(jīng)軸突通路時，可選擇>6μm的厚切片；

超厚切片(20–40μm)：適合細(xì)胞體視學(xué)定量分析和漂浮切片實(shí)驗(yàn)；

注：較厚的切片可能需要在后續(xù)流程中進(jìn)行更長時間的孵育；厚冷凍切片可在封閉步驟中加入去污劑以提高組織通透性。

切片完成后，載玻片需要在室溫下自然晾干約24小時，或者在50-60℃的烘箱中烘干1小時，在烘箱中烘干時必須密切留意，因?yàn)樵诟邷叵麻L時間烤片可能會降低免疫原性。有些組織還可以放在50℃恒溫烤片機(jī)上加熱30-60分鐘，這樣可以避免樣本從載玻片上脫落。使用化學(xué)粘附試劑(如VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion，貨號SP-1800)，有助于組織在原位雜交、高溫抗原修復(fù)等嚴(yán)苛條件下仍牢固附著在載玻片上。

FFPE樣本切片后需進(jìn)行脫蠟和水化。這個過程的順序(圖2)與石蠟浸透時的脫水步驟完-全相反：

?. 二甲苯脫蠟

?. 梯度酒精復(fù)水

圖2. 脫蠟、復(fù)水步驟簡易圖

脫蠟不-徹-底會導(dǎo)致同一樣本中同一 抗原染色出現(xiàn)不均勻或呈斑片狀，使用新鮮配制的試劑是避免這一問題的措施之一。另外，載玻片在每種溶液中浸泡的時間必須適當(dāng)，且切片越厚所需時間越長；例如，4-5μm的切片完-全脫蠟，至少需要2次二甲苯浸泡，每次5分鐘；更厚的切片可延長時間或增加次數(shù)。

福爾馬林固定會使組織蛋白質(zhì)的氨基酸之間形成交聯(lián)。雖然這一過程對于硬化組織和維持形態(tài)至關(guān)重要，但該過程也會掩蓋抗原表位、降低抗原性，導(dǎo)致染色弱或無染色。抗原修復(fù)步驟可幫助恢復(fù)被掩蓋的表位，從而獲得最佳的染色效果。

熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)(HIER)：即在特定緩沖液中加熱組織以破壞交聯(lián)(圖3)，相比于酶解法具有明顯的優(yōu)勢。可選擇的加熱設(shè)備有微波爐、高壓鍋、水浴鍋或高壓滅菌器，高壓鍋和高壓滅菌器可以在不發(fā)生劇烈沸騰的情況下將樣本加熱至100℃以上，微波爐也具備這個優(yōu)勢，且專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室型號可以控制溫度，但需要密切監(jiān)控，并隨時補(bǔ)充蒸發(fā)掉的緩沖液。水浴鍋也能控制溫度，并允許在較低溫度下進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)，這可能非常適合某些特定的應(yīng)用。無論選擇哪種設(shè)備，都需要確定理想的溫度(如果設(shè)備允許)和孵育時間。一般的建議是：從低溫開始，根據(jù)需要逐漸升高，并在組織出現(xiàn)損傷跡象之前停止。

溫度對抗原修復(fù)效果的影響比緩沖液的選擇更為顯著，緩沖液的pH值同樣重要，檸檬酸鹽和Tris體系溶液是最-常-用的選擇。選擇修復(fù)緩沖液時，可以優(yōu)先參考抗體說明書，無說明書時需自行測試決定。

圖3. 熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)原理圖

樣本制備的最后一步：使用PAP筆在切片周圍畫疏水屏障圈，能將試劑限制在特定區(qū)域內(nèi)，避免同張載玻片上多種試劑混合。與傳統(tǒng)PAP筆相比，ImmEdge® PAP筆(貨號H-4000)具備以下特點(diǎn)：

?. 適用于含或不含去污劑(Tween 20、Triton X-100等)的緩沖液，屏障穩(wěn)定

?. 淺藍(lán)色疏水圈，清晰可見，兼容酶法與熒光檢測系統(tǒng)

?. 可溶于各類常用透明劑(如二甲苯等)，方便清理

?. 環(huán)保：不含《蒙特利爾議定書》及歐盟理事會認(rèn)定的破壞臭氧層的物質(zhì)

規(guī)范的樣本制作，不僅是染色成功的基石，更是確保鏡檢過程順暢無憂的關(guān)鍵。每一步選擇都必須貼合實(shí)驗(yàn)需求，任何環(huán)節(jié)操作不當(dāng)都可能影響結(jié)果。唯有前瞻性的全盤考量、科學(xué)的決策以及全程使用優(yōu)質(zhì)試劑，方能確保實(shí)驗(yàn)圓滿成功。

此外，Vector還提供其他一系列IHC/IF的相關(guān)產(chǎn)品和資料，更多詳情請聯(lián)系Vectorlabs中國總代理商—欣博盛生物