阿爾茨海默病、帕金森病以及肌萎-縮側索硬化癥(ALS)等神經退行性疾病的特征，是大腦中錯誤折疊蛋白聚集的逐漸積累。這些異常的蛋白構象會破壞正常的細胞功能，引發神經炎癥和細胞死亡。這些通常可溶的蛋白會聚集形成富含β-折疊結構的纖維，并進一步在整個大腦中誘導毒性級聯反應。這種類型的神經退化被稱為蛋白質病變，在老年人中日益常見。然而，錯誤折疊蛋白的早期檢測和監測一直具有挑戰性。現有檢測方法普遍存在靈敏度不足、背景熒光干擾較大，以及在活體組織中應用效果不理想等問題。其中最-具代表性的工具是熒光染料硫代黃素T(ThT)，它被廣泛用于識別β-折疊結構。
為了解決這一問題，麻省總醫院/哈佛醫學院 Athinoula A. Martinos 生物醫學成像中心的研究人員開發了一種新的化學發光探針。該探針既可用于對β-折疊結構進行廣泛檢測，又能夠實現對特定錯誤折疊蛋白的精準識別。在最近發表在bioRxiv 上的一篇預印本論文中，Zhu等人將他們的探針ADLumin-1 與ThT在多種與蛋白質病變相關的肽和蛋白上進行了測試。他們將這些蛋白稱為“misfoldon"，因為它們共享與此類錯誤折疊蛋白相關的共同β-折疊結構。此外，這些蛋白通常含有丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸等氨基酸。這些氨基酸可以在β-折疊結構中形成疏水性口袋。
ADLumin-1特異性結合β-折疊結構其效果優于ThT
在觀察到ADLumin-1在淀粉樣β纖維存在時化學發光信號增強后，Zhu等人確定，ADLumin-1是沿β-折疊纖維的長軸，與其內部的疏水性口袋發生結合。這種結合方式與ThT類似。基于這些發現，Zhu等人假設ADLumin-1可以作為一種針對β-折疊結構的通用探針。為驗證這一點，他們使用了模型肽PA-K2和PA-E2——這兩種肽可形成β-折疊纖維(富含Val/Ala)。此外，他們還使用了肽PA-K和PA-E，這兩種肽也能組裝成纖維，但不具有大量β-折疊結構。
研究人員表明，與背景相比，ADLumin-1在PA-K2存在下的化學發光增強了4,168倍；而在PA-K中僅約為248倍，對應強度比為16.8。與ThT相比，在PS-K2孵育條件下，ADLumin-1的信噪比比硫代黃素T高127.7倍。在PA-E/PA-E2肽中也得到了類似結果。在證明了ADLumin-1能夠以高于ThT的靈敏度特異且穩定地結合β-折疊結構之后，研究人員決定將其與一系列與疾病相關的misfoldon進行測試。
將其分別與StressMarq的Tau(K18)P301L突變體預制原纖維(目錄號 SPR-330，StressMarq產品可通過中國總代理商欣博盛生物購買)、α-突觸核蛋白、淀粉樣β以及TDP-43纖維混合后，均檢測到了強烈的化學發光信號，其信噪比優于ThT。與ThT相比，ADLumin-1使α-突觸核蛋白的信噪比提高了83倍，淀粉樣β提高了75倍，tau提高了15倍，TDP-43提高了11倍。此外，ADLumin-1還能夠區分單體與纖維，并能夠檢測寡聚體。不同misfoldon之間信號衰減半衰期的差異表明，ADLumin-1有可能用于區分它們。分子對接實驗進一步證實，ADLumin-1沿β-折疊纖維的長軸結合，并與由Ala、Val、Ile和Phe形成的疏水通道發生作用，這種對接方式解釋了其對多種靶標的廣泛適用性。
圖1.［引自 StressMarq 網站］Tau(K18)P301L突變體預制原纖維(PFFs)(目錄號：SPR-330)的透射電子顯微鏡(TEM)圖像
ADLumin-1可用于Tau和TDP-43的體內成像
Tau是與阿爾茨海默病(AD)密切相關的關鍵蛋白，它會在患者大腦中聚集并形成纏結。在對AD患者腦切片進行染色時，ADLumin-1能夠與抗Tau抗體實現共定位。在野生型(WT)和tau P301突變小鼠中，注射ADLumin-1后，利用動物成像系統在不同時間點記錄化學發光信號。在突變型與WT小鼠之間觀察到了顯著的化學發光差異。這兩項關于Tau的研究均表明，ADLumin-1能夠在體內有效檢測Tau纏結。
在肌萎-縮側索硬化癥(ALS)中，TDP-43會在大腦和脊髓的運動神經元中發生聚集。在對野生型和A315T轉基因小鼠(ALS模型)進行的類似實驗中，經靜脈注射探針后，A315T小鼠的信號高于WT小鼠。在A315T小鼠切片中，ADLumin-1檢測到了包涵體，并通過與抗體的共定位得到了驗證。
通過ChRET可增強α-突觸核蛋白的體內成像
在帕金森病(PD)中，α-突觸核蛋白的聚集起核心作用，會形成具有毒性的寡聚體和纖維。因此，無論在體外還是體內實現對α-突觸核蛋白的可靠檢測，對于PD研究都具有重要意義。Zhu等人能夠以飛摩爾級別的靈敏度檢測α-突觸核蛋白，優于ThT。通過結合蛋白錯誤折疊循環擴增(PMCA)和“種子"誘導方法，他們成功在腦脊液(CSF)中檢測到α-突觸核蛋白。這一檢測為其在體外診斷中的應用提供了可能。重要的是，ADLumin-1同樣能夠在PD患者腦組織中檢測到α-突觸核蛋白，這一點至關重要，因為它有望應用于腦組織的死后分析。
在研究人員開展的體內實驗中，將α-突觸核蛋白聚集體經顱內注射至小鼠，并用ADLumin-1進行標記。隨后，他們采用三維彌散發光成像斷層技術(DLIT)。該技術僅在接種部位檢測到局部化學發光信號，從而證實了對腦深部α-突觸核蛋白的選擇性檢測。在腹腔注射ADLumin-1后，過表達人α-突觸核蛋白的轉基因A53T小鼠，其腦部信號較野生型高出2.1倍。在4至12個月的縱向分析中，A53T與WT小鼠之間的信號比上升至2.6倍，與疾病進展趨勢相一致。隨后，研究人員通過離體組織學染色驗證了α-突觸核蛋白的積累。
在確認ADLumin-1能夠在體內追蹤α-突觸核蛋白傳播后，研究人員進一步開發了一種方法，以同時增強信號并實現對α-突觸核蛋白的選擇性成像。他們采用了一種生物正交的化學發光共振能量轉移(ChRET)技術，將作為化學發光供體的ADLumin-1與熒光受體配對。該受體可特異性結合α-突觸核蛋白(CRANAD-14)。采用該方法，可在活體轉基因A53T小鼠腦中實現對α-突觸核蛋白的精確成像，并能夠與阿爾茨海默病轉基因小鼠模型(5xFAD)中的錯誤折疊淀粉樣β加以區分。
總 結
ADLumin-1的信噪比最高可達ThT的128倍，是一種用于檢測與神經退行性相關的錯誤折疊蛋白的有前景的新型試劑。淀粉樣β、tau、α-突觸核蛋白和TDP-43等蛋白會發生病理性聚集，形成纖維，并呈現出ADLumin-1可結合的疏水性β-折疊結構。此外，這種化學發光探針還具有更高的靈敏度、無自發熒光以及可實現深層組織穿透等優勢。它能夠以飛摩爾級靈敏度在腦脊液中檢測α-突觸核蛋白，并能在活體轉基因小鼠疾病模型中對tau、α-突觸核蛋白和TDP-43的聚集體進行無創可視化，這是ThT無法實現的。
此外，當研究人員將ADLumin-1與其開發的熒光探針CRANAD-14結合，應用于生物正交的ChRET檢測體系時，他們能夠在活體小鼠大腦中對α-突觸核蛋白進行精確成像，并區分α-突觸核蛋白與淀粉樣β。這種高靈敏度的體內技術有望成為研究和監測多種蛋白質病變的重要工具。
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參考文獻
1. Highly sensitive chemiluminescence imaging of misfolded proteins in neurodegenerative models. Zhu, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
2. Detection of misfolded proteins in neurodegenerative disease models with a highly sensitive chemiluminescence. Zhu, B. et al., bioRxiv, (preprint)
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